大肠液的分泌—重大消息,记着曝光-资讯中心-景钰丽文具用品

概括

原核表达系统为表达有价值的重组蛋白、酶和治疗产品提供了优势。传统微生物技术逐步发展并与先进技术相结合，促进产品代谢物、重组生物制品、工业酶的表达。最近，一些先进的方法已应用于细菌表达，以促进重组蛋白的表达。这些方法包括使用新型载体颗粒（例如有效激活剂、诱导剂、增强剂、蛋白质标签和分泌信号）的代谢工程、用于克隆的高通量设备、筛选过程和发酵技术。大肠杆菌的新技术进步使得复杂产品的表达变得不可能，包括小肽、抗体片段、次要蛋白质和完全测序的糖基化单克隆抗体。瓦克的分泌技术、诱导剂、无细胞系统以及用于翻译后修饰（例如二硫键和细菌N末端糖基化）的菌株工程仍需要评估其在大肠杆菌中表达复杂蛋白质和肽的有效性。

本文提供了一种最近流行的表达技术的想法，以提高外源蛋白在大肠杆菌中的表达，最重要的是它们在微生物和生物制药中的应用。

前言

许多微生物产品具有重要的工业和研究价值，但不易从自然界中获得。大肠杆菌中的重组DNA技术提供了一种以低成本实现高表达水平和可扩展工艺的有前途的方法。

任何生物制药的商业成功都取决于有效扩大规模和表达大量重组产品的能力。其次，随着膨化产品产量的增加，成本可以降至最低。利用生物遗传修饰制备重组蛋白产品需要1.选择合适的克隆载体、克隆元件和宿主2.产生稳定、高产、高质量的重组克隆3.可扩增、一致、高产和优化发酵工艺4.纯化工艺廉价、方便。

对于重组蛋白的生产，大肠杆菌是的表达系统，使用新型诱导剂可以使蛋白在诱导后短短6小时内过表达。据报道，大肠杆菌只需一步纯化即可以折叠、可溶、有功能的形式表达人类突变基因工程溶菌酶。

大量数据表明，大肠杆菌表达系统是重组蛋白表达的高性能系统。例如，单序列组合和瓦克分泌技术提高大肠杆菌周质空间内的蛋白质表达和胞外分泌效率。在N片段或C末端添加不同的标签可提高蛋白质溶解度和纯化亲和力。随着细菌培养温度逐渐降低至30、28、23、10、15和4，表达蛋白的溶解度显着增加。低温还可以提高蛋白质稳定性和正确折叠。密码子优化可以指数级提高蛋白质表达。先进的高通量筛选设备和优化的发酵工艺可以提高蛋白质表达。在现代微型反应器中实现DOE并优化上游流程可以显着缩短开发时间并成倍增加蛋白质表达。使用通用、严格控制的表达系统、新型激活剂和大肠杆菌糖工程细胞可以确保所需重组产物的高水平表达。此外，宿主/菌株、载体、工艺和新技术还有持续改进的空间，以提高重组产品的表达效率。

共同宿主大肠杆菌

大肠杆菌是学术界和生物制药行业最常用的重组蛋白表达系统之一，以其遗传特性而闻名。全临床广泛使用的许多生物药物都是在大肠杆菌中表达的。

图1传统蛋白质制造工艺

表1已批准的治疗性生物蛋白和临床适应症的更新列表

大肠杆菌表达系统与其他表达系统相比具有许多优点，其细胞生物学特性众所周知，易于操作，发酵过程简单，制造成本低，可以大量表达重组蛋白。你有。数量。最近的研究表明，许多治疗性蛋白质和工业酶是使用大肠杆菌作为宿主表达的。在大肠杆菌中，靶蛋白可以在细胞内表达为不溶性蛋白质聚合物，例如包涵体或可溶性分泌蛋白。

该表达系统的另一个缺点是在大肠杆菌中不可能进行翻译后修饰，导致产生的重组产物处于非功能状态。如果蛋白以包涵体的形式表达，下游过程就非常繁琐。大肠杆菌中包涵体的形成是由于缺乏必要的细胞器和细胞质中外源蛋白的过度表达。为了克服这些挑战，通过以允许蛋白质正确折叠并最大限度地减少蛋白质降解的方式掺入适当的信号肽序列，在大肠杆菌的周质腔或细胞外空间中表达重组蛋白。这些信号序列可以从自然界获得，也可以通过先进的生物信息学工具设计合成。大肠杆菌BL21DE3和K12宿主已广泛用于各种生物制药的制造。

有多种分子工具和方法可以高水平表达外源蛋白，例如多重表达质粒、工程宿主和生长培养策略。大肠杆菌可用于以所需产量表达从低分子量到相对高分子量的蛋白质。然而，这不适用于蛋白质表达困难的情况。

提高大肠杆菌表达水平的最新技术

许多新技术和高通量方法被用于大肠杆菌克隆和工艺改进。更大的挑战是开发重组蛋白和酶的快速且可扩展的生产工艺。根据外源蛋白的特性来预测表达系统、载体颗粒、分泌信号、蛋白生产条件和发酵过程是不现实的。大肠杆菌表达是重组蛋白制剂的表达系统，但它不能像真核宿主那样以分泌形式产生正确折叠的活性蛋白。因此，下文描述了在大肠杆菌中表达目的蛋白的各种方法和技术。还描述了一些在大肠杆菌中表达更好质量和更多外源蛋白质的先进技术。与现有技术相比，新技术的优缺点如表3所示。

大肠杆菌中密码子优化的基因表达

功能蛋白在工程宿主中的有效表达是各种新技术的根本基础。不幸的是，如果表达宿主被超转化，则由于不同生物体中密码子序列不同，基因不能有效表达。最近，密码子替换已被证明可显着影响蛋白质折叠和基因表达水平。

合成生物学的基本技术旨在创造含有合成和工程基因的修饰生物体，用于制造重组治疗蛋白、工业酶和生物燃料。使用标准生物学和控制元件构建各种新，包括诱导子、激活子、核糖体结合位点、转录终止子等。此外，合成生物学可以提供多种遗传元件，例如激活子、终止子、诱导子和RBS，以提供不同水平的蛋白质表达。目前，在学术界和生物制药界，密码子优化的基因被广泛用于表达研究和利用大肠杆菌系统高效生产外源蛋白。

与十年前相比，合成基因并没有显示出任何优势，并且可以根据需要操纵大量的合成DNA片段。而且，它们可以组装成完整的基因进行复制。密码子优化方法可以将蛋白质表达水平提高数倍。密码子优化过程或生物合成途径重新设计可提高重组蛋白和代谢物的体积产量。这促进了低成本工艺和产品生产。此外，这影响了生物技术的经济可行性。

表2工业重组蛋白产品

图2大肠杆菌工艺和产量技术创新的拟议工作流程。

表3先进技术的优缺点

使用新的启动子来改善表达

重组蛋白在原核宿主中高表达是一个重要突破。T7噬菌体聚合酶可识别T7噬菌体启动子系统，并广泛用于从原核系统中的载体元件制造蛋白质产品。然而，使用该聚合酶和启动子系统3-5代后，观察到蛋白质产物的表达水平逐渐下降。人们已经应用了许多策略来克服这些困难，但不幸的是，没有一个策略被充分证明是有效的。很多情况下，这个表达系统运行良好，表达的目的蛋白占细胞总蛋白的50%以上。

最近，启动子已被用来在大肠杆菌中表达外源蛋白，从而实现高蛋白产量。然而，这些启动子不能稳定表达所需的大量重组蛋白。在多种情况下都可以观察到蛋白质表达减少，这可能导致工业生物制药的制造成本更高和质量不稳定。

ExpressionT7Cp/p系统解决了连续培养中表达减少的题，这是一种消除连续生长培养中无功能细胞的新策略。该系统与常用的启动子不同，在常规启动子死亡的细胞中由于聚合酶功能丧失、T7RNA聚合酶启动子和其他错误影响重组蛋白的表达。因此，含有目的基因的重组细胞可以维持在培养物中，并且可以实现稳定的高水平蛋白质表达。

新的T7Cp/p系统是基于由导入表达载体的T7启动子控制的表达盒开发的。将编码APH的选择标记卡那霉素抗性诱导基因与ECKm盒组合用于克隆筛选和选择。为了表达聚合酶选择标记卡那霉素，将转录终止序列插入APH基因的5'端。非噬菌体启动子通过转录终止子基因插入ECKm盒中，以防止选择标记的表达。因此，选择性标记APH基因的表达受到T7噬菌体启动子的严格控制，并且新型盒表现出所需的特性。新颖的结构设计提高了大肠杆菌表达中目标蛋白的蛋白质生产效率和成本竞争。

此外，还进行了许多实验来评估新的启动子系统，所有这些都成功地实现了高水平的长期蛋白质表达而没有缺陷。这种新的启动子T7Cp/p系统用于增强已经广泛使用的T7噬菌体RNA聚合酶/基于T7启动子的表达系统。这种新的启动子系统可以在学术和工业生物制药环境中显着增加小规模和大规模重组蛋白的产量。通过应用新的启动子系统也可以降低纯化成本。

Cumate-诱导型，一种新型表达系统。

已经开发了多种载体和表达系统来应对重组蛋白生产的挑战。更好的启动子可以通过替换常用的T7噬菌体或其他启动子来改善大肠杆菌RNA转录。使用稳定的结构或严格控制的启动子，可以将靶基因克隆到上游，并实现高水平的蛋白质生产。自诱导启动子还可用于大肠杆菌中的稳定基因发育和蛋白质表达。

最近，一些新颖的、严格控制的载体系统已被用于在大肠杆菌中高水平表达蛋白质，其中使用了恶臭假单胞菌F1cym和cmt操纵子的标准元件。通过使用化学诱导剂cumate，这两个操纵子在转录调控水平上控制靶基因的表达。与IPTG相比，cumate是一种无化学诱导剂，可诱导表达盒中基因的转录组装。使用cumate基因开关生成用于蛋白质表达的特殊pNEW载体，该载体包含与合成操纵子偶联的局部T5噬菌体启动子以及感兴趣基因的阻遏蛋白cymR的组成型表达。

Cumate表达系统相对于IPTG诱导的pET表达系统具有许多优点，包括1高产量，2.严格控制基因表达，3.完全诱导和均匀的蛋白质制备，4.使用不同浓度的Cumate。5.诱导后8小时即可诱导细胞，因此产量高。

与基于pET的IPTG诱导系统相比，基于Cumate的pNew载体可以实现3至6倍的高表达。该系统提高了工业蛋白质和酶的表达水平。改进的表达可以降低发酵、纯化和原材料消耗成本。

大肠杆菌工程中二硫键的形成和糖基化信息

在任何蛋白质中，蛋白质折叠和二硫键的正确连接对于蛋白质